핵산 추출은 분자 생물학 실험의 초석입니다. 그러나 시중에 나와 있는 방대한 상업용 추출 키트 앞에서 많은 연구자들은 특히 예상치 못한 결과에 대한 문제 해결에 직면했을 때 당황합니다. 이 글은 핵산 추출 키트의 과학적 원리를 명확히 설명하고, 이 필수적인 기술을 "블랙박스" 작업에서 예측 가능하고 효율적인 프로세스로 전환하기 위한 실용적인 문제 해결 지침을 제공합니다.
대부분의 상업용 핵산 추출 키트는 실리카 막 스핀 컬럼 기술을 사용하며, 5가지 중요한 단계로 구성됩니다: 세포 용해, 핵산 결합, 세척 및 정제, 건조, 최종 용출. 각 단계는 이전 단계 위에 구축되므로, 한 단계에서의 실수도 전체 추출을 손상시킬 수 있습니다.
효과적인 세포 용해는 중요한 첫 단계입니다. 용해 버퍼 제형은 DNA 또는 RNA 추출 여부에 따라 다르지만, 일반적으로 이중 목적을 수행하는 고농도의 카오트로픽 염을 포함합니다:
일반적인 카오트로픽 염으로는 구아니딘 염산염, 구아니딘 티오시아네이트, 요소, 과염소산 리튬이 있습니다. 세제는 단백질 용해 및 세포 용해를 돕기 위해 자주 첨가됩니다. 샘플 유형에 따라 효소가 포함될 수도 있습니다. 단백질 분해 효소 K는 핵산 준비물, 특히 변성 조건에서 단백질을 효과적으로 소화합니다. 라이소자임도 일반적인 효소이지만, 변성 조건에서는 활성이 감소합니다.
플라스미드 추출은 RNA 또는 게놈 DNA 분리와 상당히 다릅니다. 중요한 차이점은 먼저 플라스미드 DNA를 게놈 DNA에서 분리하는 것입니다. 카오트로픽 염을 즉시 첨가하면 모든 유형의 DNA가 무차별적으로 방출됩니다. 따라서 플라스미드 프로토콜은 일반적으로 초기 세포 용해 후에 카오트로프를 도입합니다.
용해 외에도 카오트로픽 염은 실리카 컬럼에 핵산을 결합시키는 데 도움이 됩니다. 에탄올(또는 때로는 이소프로판올)은 이 결합을 향상시킵니다. 실리카 컬럼에는 염 농도 및 기타 요인에 따라 DNA 또는 RNA를 선택적으로 결합시키는 수지가 포함되어 있습니다. 결과 핵산은 복제, 장독 시퀀싱 및 기타 응용 분야에 적합한 높은 순도를 나타냅니다.
에탄올 농도는 중요합니다. 과도한 에탄올은 분해된 물질과 소분자를 침전시켜 A260 흡광도 판독에 영향을 미칩니다. 불충분한 에탄올은 막에서 염 제거를 방해할 수 있습니다. 키트에서 제공하는 에탄올 양은 사전 최적화되어 있지만, 분해된 DNA가 A260 판독값을 왜곡하는 것으로 보이면 에탄올 농도를 재최적화하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 흐름 통과 용액은 침전을 위해 보관하여 손실된 핵산을 회수할 수 있습니다. 용해에 SDS 함유 세제가 사용되는 경우, NaCl은 세제 오염을 피하는 효과적인 침전제로 작용합니다.
실리카 막을 통해 용해액을 원심 분리한 후, 표적 핵산은 컬럼에 결합하고 단백질과 다당류는 흐름 통과액에 남습니다. 그러나 막에는 잔류 단백질과 염이 남아 있습니다. 식물 샘플은 다당류와 색소를 남길 수 있습니다. 혈액 샘플은 종종 갈색 또는 노란색 변색을 유발합니다. 세척 단계는 이러한 오염 물질을 제거합니다.
일반적으로 두 번의 세척이 수행되지만, 정확한 횟수는 샘플 유형에 따라 다릅니다. 첫 번째 세척에는 일반적으로 잔류 단백질과 색소를 제거하기 위해 낮은 농도의 카오트로프가 포함되며, 그 다음 에탄올 세척으로 염을 제거합니다. 단백질이 적은 샘플(예: 플라스미드 준비물 또는 PCR 산물 정제)은 에탄올 세척만 필요할 수 있습니다. 완전한 카오트로프 제거는 높은 수율과 순도를 위해 필수적입니다. 일부 키트는 이중 에탄올 세척을 권장합니다. 잔류 염은 용출을 억제하여 수율을 감소시키고 A230 판독값을 증가시켜 A260/230 비율을 낮춥니다.
대부분의 프로토콜에는 컬럼에서 잔류 에탄올을 건조하기 위한 세척 후 원심 분리가 포함됩니다. 이 단계는 깨끗한 용출액을 위해 중요합니다. 10mM Tris 버퍼 또는 물을 첨가하면 핵산이 재수화되어 막에서 방출됩니다. 잔류 에탄올은 완전한 재수화 및 용출을 방해합니다. 에탄올은 분광 광도계로 감지되지 않지만, 징후로는 로딩 염료가 있어도 샘플이 아가로스 젤 웰에 가라앉지 않거나 -20°C에서 얼지 않는 경우 등이 있습니다.
최종 DNA 추출 단계는 실리카에서 순수 핵산을 방출합니다. DNA의 경우, pH 8-9의 10mM Tris가 표준입니다. DNA는 약알칼리성 pH에서 더 안정하며 물보다 버퍼에서 더 빨리 용해됩니다. DNA 침전물도 유사하게 거동합니다. 물은 일반적으로 pH가 낮고(4-5) 고분자량 DNA는 빠르게 완전히 재수화되지 않을 수 있습니다. 최대 DNA 회수를 위해 원심 분리 전에 버퍼를 막에 몇 분 동안 그대로 두십시오. intact한 고분자량 DNA(예: 장독 시퀀싱)가 필요한 응용 분야의 경우, 용출 버퍼가 최적입니다. RNA는 약산성 pH를 견디며 물에 쉽게 용해되므로, 물이 선호되는 희석제입니다.
표준 프로토콜을 따르더라도 추출 과정에서 다양한 문제가 발생할 수 있습니다:
불완전한 용해는 예상보다 낮은 수율, 불완전한 단백질 용해 또는 낮은 A260/230 비율로 나타날 수 있습니다. 이는 특정 샘플 구성 요소가 추출 중에 완전히 용해되지 않았음을 시사합니다. 불완전한 용해를 오염 또는 분해와 구별하려면 용해 버퍼 구성, 배양 매개변수 및 잠재적 방해 물질을 포함한 추출 조건을 신중하게 분석해야 합니다. 예를 들어, 낮은 A260/230 비율은 불완전한 용해보다는 결합 후 잔류 염 또는 불충분한 세척을 나타낼 수 있습니다. 불완전한 용해를 해결하려면 용해 버퍼 구성, 배양 시간을 최적화하거나 추가적인 기계적/효소적 용해 방법을 통합해야 할 수 있습니다.
특수 기술은 환경 샘플에서 핵산과 함께 공동 정제될 수 있는 부식산 물질 및 기타 방해 물질을 제거하는 것을 목표로 합니다. 여기에는 양이온을 선택적으로 결합하고 제거하기 위해 킬레이트제(예: EDTA)를 포함하는 특수 추출 버퍼가 포함됩니다. 차등 원심 분리 또는 여과와 같은 사전 처리 방법은 핵산 추출 전에 환경 샘플에서 더 큰 입자 물질을 제거하는 데 도움이 되어 결합 단계 중 간섭을 줄일 수 있습니다.
특정 샘플(예: 조직 또는 지질이 풍부한 물질)은 특정 문제를 제기합니다. 조직 샘플은 완전한 용해 및 핵산 방출을 보장하기 위해 추가적인 기계적 파쇄 또는 효소 소화가 필요한 경우가 많습니다. 지질이 풍부한 샘플은 지질이 컬럼 매트릭스에 대한 핵산 결합을 방해할 수 있으므로 정제가 복잡해질 수 있습니다. 이러한 문제를 해결하려면 용해 버퍼 구성을 수정하거나, 정제 프로토콜을 최적화하거나, 특별히 설계된 키트를 사용해야 할 수 있습니다.
최초 발행일: 2010년 6월 28일. 2021년 5월 및 2024년 3월 검토 및 재발행.
담당자: Ms. Lisa
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